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基于水两相乳液(ATPE)的生物墨水是生物打印的一项创造性立异，好像制造具有大孔结构的复杂3D细胞负载水凝胶，从而促进支架内的细胞行为。但是，这些生物墨水试验上枯竭相识性和特定的生物功能，可能限定它们在靶向组织工程中的专揽。

针对此问题，来自芬兰埃博学术大学的Xiaoju Wang/Tuomas Näreoja团队将低于0.1%的磷酸化纤维素纳米纤维(pCNF)引入基于葡聚糖/甲基丙烯酸明胶(GelMA)的ATPE系统中，用于基于挤出的前成骨细胞生物打印细胞制造具有成骨分化后劲的大孔水凝胶（图1）。水凝胶内的有序界面促进了体外宏不雅生物矿化结节的变成。

筹备商榷后果以“Bioprinting Macroporous Hydrogel with Aqueous Two-Phase Emulsion-Based Bioink: In Vitro Mineralization and Differentiation Empowered by Phosphorylated Cellulose Nanofibrils”为题于2024年3月14日发表在《Advanced Functional Materials》上。

图1 p_ATPE生物墨水进行生物打印经由的暗意图

1. 水凝胶墨水的盘算推算、流变特质以及机械特质

为了长远了解pCNF分拨行为，对基于ATPE的墨水进行了共焦显微镜分析（图2a、b）。当使用含有约150 mm NaCl的PBS制备基于ATPE的墨水时，产生了透明乳液（图2a(i)），并在GelMA（红色）相中变成了单独的葡聚糖（绿色）微滴。通过将GelMA熔解在pCNF分散体中，然后将其与葡聚糖溶液羼杂来引入pCNF后，GelMA和葡聚糖相之间的相分离仍然存在，如图2a(ii-iv)所示。与在PBS缓冲液中制备的油墨比较，在HEPES缓冲液中制备的基于ATPE的油墨阐发出更小的葡聚糖液滴尺寸（图2b(i)）。作家进一步商榷了墨水制备经由中熔解身分的限定，以详情它是否会影响pCNF分拨行为。收尾标明，即使pCNF起初熔解在葡聚糖中并随后与GelMA溶液羼杂，pCNF最终也会迁徙到GelMA相。在生物打印中，带负电荷的pCNF在低离子强度下与GelMA相的连合保留了p_ATPE墨水的大孔变成才智，如图2b(v)所示。

图2 水凝胶墨水的盘算推算

生物墨水的流变特质在决定其在生物打印中的举座性能方面施展着要道作用，卓绝是基于挤出的生物打印应振奋剪切稀化、快速回复和即时交联反应性等一系列流变特质。GelMA的热依赖性溶胶-凝胶转机关于生物打印格外有益，况兼基于ATPE的墨水也保捏了这些特质（图3）。作家进行了全面的流变表征，以商榷pCNF对葡聚糖/GelMA ATPE油墨流变特质的影响。总的来说，pCNF行为一种有用的流变改性剂和ATPE相识剂，不错故意于ATPE生物墨水的生物打印和生物打印后经由。为了解释p_ATPE墨水在基于挤出的3D打印中的可打印性和打印保真度，使用Lp_ATPE墨水制造了复杂的厘米级3D结构（图3g-i）。

图3 水凝胶墨水的基本特质

为了商榷pCNF对水凝胶机械性能的影响，作家测试了水凝胶圆柱体的压缩应力-应变弧线。ATPE水凝胶阐发出比块状水凝胶更高的杨氏模量和最大应力（图4c），这主若是由于GelMA交联密度加多所致。pCNF上的名义磷酸基团为p_ATPE水凝胶提供了与生物系统中存在的二价阳离子进一步交联的契机。作家商榷了Ca2+与pCNF交联(Ca2+(X))对机械性能的影响。如图4a-e所示，Ca2+(X) p_ATPE水凝胶的机械性能与非交联水凝胶保捏一样的趋势，Ca2+(X) Mp_ATPE水凝胶的最大应力和韧性略有加多至276.5±52和分辩为30.5±4.6 kPa（图4c、e）。在轮回压缩测试中，所有这个词水凝胶在重迭压缩100次轮回后王人阐发出很强的恢回复始面目的才智，卸载弧线回复到原始点（图4g）。图4h解释了基于ATPE的水凝胶的大孔结构变成才智，其中本色水凝胶呈现出平坦且细巧的结构。此外，跟着pCNF的加入，p_ATPE水凝胶中的千里淀速率大大加多（图4i），况兼在p_ATPE水凝胶中不雅察到Ca/P复合物的片状结构。

图4 水凝胶的机械性能

2. 生物墨水的生物相容性

为了阐述p_ATPE水凝胶的生物相容性，卓绝是pCNF对细胞活力、扩散和增殖的影响，作家对p_ATPE水凝胶进行了CCK-8测定。CCK-8标明ATPE水凝胶阐发出增强的生物相容性，这归因于其大孔结构故意于细胞铺展和传质。为了评估生物打印后的细胞活力，咱们对生物打印的水凝胶进行了活/死染色，如图5b所示。p_ATPE水凝胶显现出显然更高的活力(培植 90%)，进一步证实了p_ATPE水凝胶内细胞的快速回复。细胞均匀散布在所有这个词这个词生物打印的水凝胶中，况兼跟着培养时辰的加多而加多（图5e）。细胞骨架染色（图5f）进一步考证了培养7天后MC3T3-E1在生物打印水凝胶中的扩散。生物打印MC3T3-E1细胞的代谢活性和活力标明，pCNF显然增强了ATPE生物墨水的细胞相容性，并在所有这个词这个词生物打印经由中创造了稳妥的环境，促进了封装细胞的细胞活性。

图5 水凝胶和生物打印的细胞相容性分析

3. 生物墨水的体外成骨才智

接着，为了评估生物墨水的骨相易性，在莫得非常成骨刺激的闲居培养基中培养的生物打印MC3T3-E1细胞中测量了碱性磷酸酶（ALP）酶活性（早期成骨分化的决议）。如图5d所示，生物打印水凝胶的ALP活性在第7天时莫得显然相反。但是，到第14天，所有这个词水凝胶中细胞的ALP活性均有所加多，而且，这种加多在p_ATPE水凝胶中显然更高与本色水凝胶和ATPE水凝胶比较，标明pCNF具有显然的成骨刺激作用。

跟着ATPE水凝胶中加入pCNF，当水凝胶进行Ca2+交联时，细胞的矿物资变成略有增强，大的多细胞矿化结节的变成解释了这一丝（图6a(ii)和(iii)）。Ca2+交联的pCNF收罗促进了生物矿化的结节样子（图6）。这些收尾标明，当所有这个词相易剂、pCNF、Ca2+交联和OM科罚协同专揽时，会发生最强的生物矿化。

图6 ECM矿化检测

综上，本文建议了一种掺入pCNF的葡聚糖/GelMA ATPE生物墨水系统，用于MC3T3E1细胞的基于挤出的生物打印，以制造促进矿化和成骨分化的大孔水凝胶。pCNF在低离子强度缓冲液中接纳性地分拨到GelMA相中，并变成物理缠结收罗，这显然增强了ATPE生物墨水的相识性，而不装璜大孔的变成。pCNF的加入不错改善流变特质，故意于ATPE生物墨水的生物打印经由。pCNF上丰富的名义磷酸盐充任局部成核中心，并在少许存在时加快水凝胶内的生物矿化。总体而言，pCNF极地面增强了ATPE生物墨水的举座性能，并赋予其在体外3D骨模子工程中的后劲。

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